Biakan. Isolasi bakteri selalu diperlukan
untuk mengelompokkan strain (liat “Metode Molekuler” dibawah). Untuk diagnosa
definitif brucellosis, pilihan sample yang akan diambil bergantung pada gejala
klinis yang diamati. Dalam kasus Brucellosis klinis, sample yang harus diambil
adalah janin yang di abortuskan (perut, limpa dan paru-paru), selpaut janin,
cairna vagina, kolostrum, susu,sprema, dan cairan yang dikumpulkan dari arthritis atau higroma. Pada individu yang disembelih, untuk tujuan mengkonfirmasi terhadap kasus dugaan
brucellosis akut atau kronis jaringan yang dianjurkan untuk diambil sebagai
sample adalah nodus limphatikus area genital dan oropharyngeal, limpa, dan glandula
mammae serta nodus lympmatikus terkait. Untuk isolasi terhadap bakteri Brucella spp., medium yang paling sering
digunakan adalah medium Farrel, yang mengandung antibiotik yang mampu untuk
menghambat pertumbuhan bakteri lain yang ada di dalam sampel. Beberapa spesies Brucella, seperti tipe Brucella abortus yang ada di alam liar
(biovar 1 – 4), perlu CO2 untuk pertumbuhan, sementara yang lain, seperti tipe Brucella abortus yang ada di alam liar
(biovar 5,6,9), vaksin Brucella abortus
strain
S19, Brucella melitensis, dan Brucella suis, tidak. Unutk sampel yang
memiliki konsistensi berupa cairan, sensitivitas pengujina akan meningkat
apabila menggunakan media biphasic seperti media Castaneda, pada awalnya digunakan untuk
kultur darah manusia. Pertumbuhan mungkin akan nampak setelah – hari, tapi
biakan/kultur akan dianggap negatif setelah 2-3 minggu masa inkubasi.
Identifikasi Brucella spp. didasarkan
kepada morfologi, pewarnaan dan profil metabolisme (katalase, oksidase dan
urease).
Biotyping. Pengelompokan biotipe dari Brucella spp. dilaksanakan dengan
menggunakan uji yang berbeda, yang terpenting dilaksanakan uji agglutinasi
dengan menggunakan antibodi terhadap LPS kasar atau halus, misalkan,
menggunakan antibodi terhadap epitop A atau M
dari rantai Lipopolisakarida (LPS) “O” (O-LPS), lisis oleh phague, kebergantungan terhadap CO2
untuk pertumbuhan, kemampuan untuk memproduksi H2S, kemmpuan tumbuh pada
kondisi basa fuchsine atau thionin, dan uji kristal violet atau
akriflavine. Agar dapat memberikan hasil yang terpercaya, teknik ini harus
dilaksanakan menggunakan prosedur yang telah di standardisasi dan dilaksanakan
oleh personel yang sudah berpengalaman. Sehingga, metode ini lebih sering
dilaksanakan pada laboratorium referensi.
Metode-metode molekuler. Teknik-teknik baru yang memungkinkan
untuk identifikasi dan penentuan tipe Brucella
secara cepat telah dikembangkan dan digunakan pada laborratorium diagnostik
tertentu.
Identifikasi. Telah dikembangakan beberapa metode
dengan mendasarkran kepada metode PCR. Metode-metode validasi yang terbaik
adalah yang berdasarkan pada deteksi sequence
spesifik dari Brucella spp.,
seperti gen 16S-23S, insersi
sequence IS711 atau gen bcsp31 akan mengkode sebuha protein
31-kDa. Pada awal mulanya teknik ini dikembangkan pada isolat bakteri dan pada perkembangannya juga digunakan untuk
mendeteksi Brucella spp. DNA pada
sample klinis. Perlu dievalusi dalam hal ekstraksi DNA yang dapat menurunkan
sensitivitas uji PCR. Perlu dicatat bahwa sebagian besar teknik ini telah divalidasi
pada sampel manusia, namun beberapa laporan mengevaluasi penerapannya bagi
sample klinis veteriner. Baru-baru ini satu teknik telah dievaluasi dengan baik
untuk mendiagnosa Brucella suis biovar
2 pada sample klinis babi hutan yang berasal dari Swiss. Menjadi hal yang sulit
untuk memberikan perkiraan sensitivitas dan spesifitas terhadap teknik teknik
ini karena protokol-protokol uji menjelaskan bahwa masing-masing artikel
tidaklah sama. Namun demikian, sebagai aturan umumn teknik PCR Brucellosis menunjukkan sensitivitas
diagnostik yang lebih rendah daripada metode kultur, meskipun spesivitas mereka
mendekati 100 %. Sejauh ini hasil terbaik dihasilkan dengan menggabungkan
metode kultur dan deteksi menggunakan PCR pada sampel klinis.
Identifikasi Molekuler. Untuk dapat menentukan tipe dari Brucella spp., AMOS PCR multipleks,
dinamai berdasarka penggunaannya yang untuk mendeteksi spesies abortus, mellitensis, ovis, suis. PCR
ini beserta dengan protokolnya memungkinkan untuk dapat membedakan berbagai
macam spesies Brucella dan membedakan
antara vaksin dengan strain yang berasal dari alam liar. Namun demikian mereka
tidak dapat membedakan semua biovar dari semua spesies Brucella. PCR multiplex “Bruce
Ladder” adalah metode pertama yang di desain untuk mengidentifikasi dan
mendifferensiasikan semua spesies Brucella
yang telah dikenal dan strain vaksin pada uji yang sama. Kekurangan dari
metode-metode yang dikembangkan dengan berdasar kepada PCR adalah dalam
membedakan biovar-biovar dalam satu spesies Brucella
yang mana hal ini memicu perkembangan teknik dan metode dalam menentukan
tipe molekuler untuk Brucella spp., seperti
metode analisa RFLP (restriction fragment
Length Polymorphism) dengan berdasar kepada insersi sequence dengan nomor IS711.
Namun demikian, metode ini belum
terbukti sebagai metode yang sangat berguna. PCR RFLP dengan berdasar
kepada analisa restriksi terhadap gen Brucella
dalam mengkode protein membran luar adalah metode yang sederhana untuk
diterapkan, namun tingkat polimorfise adalah rendah dan tingkat ketahanannya lemah.
Beberapa teknik identifikasi terbaru tampak menjanjikan untuk dapat
mendifferensiasikan isolat dari biovar yang sama dari satu spesies yang ada : singler-nucleotide polymorphism, polimorfisme
nukleotida tunggal, yang mendeteksi perbedaan nukleotida tunggal dalam urutan
DNA dari satu spesies : MLSA, yang mendeteksi variasi sequence DNA dalam satu set gen-gen pemelihara tubuh, dan
mengkarakterisasikan strain melalui profil unik allel mereka ; dan MLVA yang menganalisa variasi lokus-lokus yang
mengandung sequence yang diulang.
Untuk lebih singkatnya, metode
identifikasi tipe secara klasik dapat membedakan biovar-biovar dari Brucella, namun, sebentar lagi singler-nucleotide polymorphism, MLSA,
dan MLVA akan menjadi teknik identifikasi yang secara rutin dilaksanakan untuk
dapat membedakan strain pada level biovar yang sama, yang memungkinkan analisa
epidemiologi molekuler.
Sumber : ada pada penulis