Metode Uji Diagnostik Tidak Langsung (in direct diagnostic test methods) Terhadap Brucellosis pada Ternak dan Satwa Liar

Uji ini berasal dari penelitian yang telah dilaksanakan terutama pada diagnosis brucellosis pada sapi. Sebagian besar uji dapat juga dilaksanakan pada kambing dan domba, kecuali Milk Ring Test, yang mana tidak dapat dilaksanakan pada kambing dan domba karena terlalu banyak memberikan hasil positif palsu. Pada babi, pada beberapa daerah tidak jarang diketemukan infeksi oleh Yersinia enterocolitica serotipe O : 9 (YO9), terutama di Eropa. Semenjak YO9 dan Brucella berbagi sebuah rantai O polisakarida, antigen Brucella spp. yang digunakan dalam uji serologi bereaksi sama baiknya dengan permukaan halus LPS dari YO9 dan sehingga antigen tidak dapat membedakan antara 2 patogen ini. Dengan demikian, seperti yang telah ditentukan oleh OIE, tak satupun dari uji serologi konvensional yang digunakan untuk mendiagnosa brucellosis babi dapat diandalkan untuk mendiagnosa babi secara individual.

Beberapa kajian serologi terhadap brucellosis telah dilaksanakan pada hewan liar dan juga pada hewan koleksi kebun binatang, dengan tujuan untuk melihat keberadaan atau penyebaran spesies Brucella spp. dalam spesies liar yang berbeda dan untuk mengelompokkan spesies atau individu sebagai individu terpapar atau non-terpapar. Pengujian serologis terhadap brucellosis biasanya dilaksanakan dengan menggunakan antigen yang sama dengan antigen yang digunakan untuk pengujian serologis pada ternak karena antigen brucella yang bersifat immunodominan, berkaitan dengan LPS halus, yang mana memiliki jangkauan yang luas yang dimiliki oleh hampir semua biovar alami dari spesies B. abortus, B. melitensis, B. suis , B. neotomae, B. ceti, B. pinnipedialis, dan B. microti. Kebanyakan uji serologis terhadap brucellosis telah diadopsi aplikasinya pada spesies hewan liar, tanpa adanya validasi, dari populasi ternak domestik, yang mana dalam kegunaannya juga tidak pernah dilaksanakan validasi.

Untuk memvalidasi uji serologis, harus dilaksanakan analisa berdasarkan status infeksi yang sebenarnya dari hewan yang bersangkutan. Keberadaan antibodi anti-Brucella mengindikasikan adanya paparan terhadap Brucella spp., namun tidak mengisyaratkan spesies brucella yang mana yang merangsang produksi antibodi tersebut. Terlebih lagi, kondisi seropositif tidak selalu berarti bahwa hewan yang bersangkutan sedang terjangkit atau terinfeksi secara aktif pada saat dilaksanakan pengambilan sampel. Bahkan, kajian terhadap infeksi eksperimental dan alami menunjukkan bahwa hampir semua spesies hewan rentan terhadap infeksi Brucella dapat kehilangan titer antibodi mereka. Ini berarti bahwa prevalensi brucellosis sesungguhnya mungkin lebih tinggi dari yang ditunjukkan oleh skrining antibodi. Oleh karena itu, "gold standard" pada penyakit brucellosis tetap isolasi Brucella spp. Jika ada dugaan terjadinya brucellosis pada ternak dan hewan liar yang berdasar kepada hasil pengujian serologis, adalah wajib untuk untuk mengisolasi organisme dan harus selalu dilaksanakan.

Publikasi tentang uji yang lainnya untuk mendiagnosa brucellosis tersedia secara on line pada halaman web OIE dalam bentuk Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Pada bab berikutnya, hanya keuntungan/kelebihan dan kekurangan dari metode pengujian yang akan dibahas.


Uji Serologis. Bagian mengacu kepada uji uji serologis untuk mendeteksi infeksi Brucella spp. “halus”. Uji uji ini tidak mendeteksi infeksi-infeksi oleh Brucella ovis dan Brucella canis. Terhadap infeksi-infeksi ini harus digunakan antigen Brucella spp. “kasar”.

Slow agglutination test atau Slow Agglutination of Wright (SAT or SAW)
Prinsip pengujian ini adalah untuk mendeteksi antibodi agglutinin terutama dari isotipe IgM yang ditujukan terhadap terhadap keberadaan Brucella spp. Pada konsentrasi optimum antigen dan antibodi, kompleks antigen-antibodi terbentuk dan terpresipitasi di bagian bawah tabung uji. Reaksi ini lambat karena, berbeda dengan tes aglutinasi cepat, pengujian ini membutuhkan masa inkubasi semalam pada suhu 37 °C. Teknik ini juga dapat dilakukan pada metode mikro (uji mikro-aglutinasi) dalam volume reaksi 100 ┬ÁL, tanpa perubahan dalam kinerja. Pembacaan hasil dapat dilaksanakan dengan menambahkan zat pewarna yang akan memberikan efek warna pada sel. Kekurangan relatif spesifitas dan sensitivitas dari metode pengujian ini sering dijadikan sebagai kelemahan utama. Namun demikian, metode ini adalah pengujian yang telah di standardisasi dan telah menunjukkan hasil yang baik dan telah terbukti berkhasiat di beberapa negara sekarang dinyatakan resmi bebas brucellosis. Spesifitas dari metode pengujian ini meningkat dengan perlakuan terhadap serum sampel dengan menggunakan agen pengikat seperti misalnya EDTA, yang mengurangi reaksi silang terhadap IgM. Meskipun uji ini tidak lagi direkomendasikan oleh OIE untuk mendiagnosa brucellosis pada sapi, metode ini masih digunakan secara luas untuk mendiagnosa brucellosis pada manusia.


Buffered Brucella Antigen Test

Metode pengujian RB (Rose Bengal) dan BA (Buffered Plate Agglutination) adalah metode uji antigen Brucella dengan larutan penyangga yang sudah umum dikenal. Pengujian-pengujian ini adalah uji aglutinasi secara cepat yang membutuhkan waktu 4 menit sampai dengan selesai pada sebuah glass plate dengan bantuan suatu antigen dengan larutan penyangga yang bernuansa asam (pH3.65 ± 0.05). Pengujian-pengujian ini telah dikenal di beberapa negara sebagai uji skrining standar karena sangat sederhana dan dianggap lebih sensitif dibandingkan dengan SAT. OIE mempertimbangkan uji ini sebagai “test yang direkomendasikan dalam dunia perdagangan”.



Complement fixation test (CFT)

CFT (Complement Fixation Test) memungkinkan untuk mendeteksi antibodi anti-Brucella yang mampu untuk mengaktifkan komplemen. Immunoglobulin sapi yang dapat mengaktifkan komplemen adalah IgG dan IgM. Merunut pada beberapa literatur, metode uji ini tidak memiliki sensitivitas yang tinggi namun memiliki level spesifitas yang tinggi. Dikarenakan metode ini sulit untuk distandarisasi, secara progressif digantikan dengan metode uji ELISA. OIE mempertimbangkan uji ini sebagai “test yang direkomendasikan dalam dunia perdagangan”.


E L I S A
Metode ELISA dibagi menjadi dua kategori, metode tidak langsung ELISA (iELISA) dan metode ELISA kompetitif (cELISA). Kebanyakan iELISA menggunakan LPS halus dimurnikan sebagai antigen tapi ada kemungkinan yang lebih bagus dengan menggunakan immunoglobulin konjugat anti-sapi. Kebanyakan iELISA mendeteksi terutama sub-kelas IgG atau IgG. Kualitas utama mereka terletak pada tingginya sensitivitas yang mereka miliki, tetapi mereka juga lebih rentan terhadap reaksi non-spesifik, terutama yang disebabkan oleh infeksi YO9. Reaksi silang yang terlihat di iELISA mendukung pengembangan cELISA. Rantai dari LPS halus Brucella mengandung epitop tertentu yang tidak dibagi dengan LPS dari YO9. Oleh karena itu, dengan menggunakan antibodi monoklonal yang ditujukan terhadap epitop tertentu dari LPS Brucella, sehingga pengembangan cELISA menjadi lebih spesifik telah dimungkinkan. Uji ini lebih spesifik, tetapi kurang sensitif, dibandinngkan dengan iELISA. OIE mempertimbangkan uji ini sebagai “test yang direkomendasikan dalam dunia perdagangan”.

Fluorescence Polarisation Assay (FPA)
FPA (Fluorescence Polarisation Assay) berdasar kepada prinsip fisik : seberapa cepat suatu molekul berputar pada suatu media cair dikaitkan dengan massa molekul tersebut. Molekul dengan ukuran yang kecil akan bergerak lebih cepat dan lebih mendepolarisasikan cahaya polar yang jatuh kepadanya, dan molekul yang berukuran lebih besar akan bergerak lebih lambat dan akan mendepolarisasikan cahaya polar lebih sedikit. FPA mengukur level depolarisasi dalam unit minipolarisasi. Selama pengujian serum sampel di inkubasikan dengan antigen specifik Brucella abortus yang ditandai dengan fluorescein isothiocyanate. Dalam kondisi adanya antibodi terhadap Brucella spp., banyak terbentuk komplek flourescen. Pada sampel negatif, antigen yang ada tetap bertahan tanpa membentuk kompleks. Molekul-molekul kecil ini berputar lebih cepat menyebabkan depolarisasi cahaya yang lebih besar daripada sampel positif pada Brucella spp. Uji ini dapat dengan mudah diotomatisasi dan sangat cepat, karena setelah antigen berlabel bercampur dengan serum pembacaan dapat dilakukan secara instan. Sensitivitas pengujian ini sepertinya berada di bawah iELISA. Spesifitasnya bervariasi berada pada kisaran 98.8 – 99.0 %. Uji ini sudah digunakan dalam pengendalian brucellosis dan digunakan dalam program sertifikasi di Amerika Utara dan di Eropa. OIE mempertimbangkan uji ini sebagai “test yang direkomendasikan dalam dunia perdagangan”.


Milk test

Uji ini di rekomendasikan oleh OIE sebagai uji yang digunakan dalam program pengandalian dan program pemberantasaan dan tidak untuk digunakan dalam tujuan perdagangan.

Milk Ring Test
Uji ini dilaksanakan dengan mencampurkan antigen Brucella yang telah diwarnai sepenuhnya dengan tangki susu segar. Dalam kondisi keberadaan antigen anti-Brucella, maka akan terbentuk komplek antigen-antibodi dan bermigrasi pada lapisan krim., membentuk cincin ungu di permukaan. Dengan tidak adanya komplek antigen-antibodi, krim akan tetap berwarna. Metode pengujian ini dianggap tidak sensitif, namu demikian kurangnya sensitivitas dikompensasikan dengan fakta bahwa pengujian dapat dilaksanakan sedara berulang-ulang, biasanya setiap builan, karena faktor biaya yang sangat rendah. Metode uji ini direkomendasikan oleh OIE hanya untuk digunakan pada susu sapi.

ELISA and Flourescence Polarisation Assay. 

Kedua metode uji ini telah dibahas pada bagian yang lalu pada konteks sampel berupa serum, namun demikian juga dapat diterapkan pada sampel yang berupa susu untuk mendeteksi hewan yang terinfeksmi. Metode uji ini kurang sensitif ketika digunakan untuk menguji sampel berupa susu jika dibandingkan dengan sampel berupa serum darah. Memang, sebelum metode uji bisa dilaksanakan pada tangki susu yang mungkin berasal dari ratusan sapi, sensitivitas metode uji ini pertama tama harus diuji pada pool sampel. Sensitivitas yang rendah dalam pengujian susu dalam tangki ini dapat dikompensasikan dengan meningkatkan frekuensi pengujian. OIE menetapkan metode uji ini untuk dipakai untuk menguji susu manusia dan ruminansia kecil.


Skin test


Skin Test adalah uji alergi yang mendeteksi respon immun selluler spesifik yang diinduksi oleh Brucella spp. injek gen brucella, ekstrak protein dari strain kasar Brucella spp., pada hewan peka diikuit dengan respon radang lokal. Tipe reaksi delayed-hypersensitivity ini diukur dengan peningkatan ketebalan kulit pada lokasi dilaksanakannya inokulasi. Metode uji ini sangat efisien untuk membedakan antara kasus positif brucellosis dengan positif palsu. Skin test sangat spesifik namun memiliki tingkat sensitivitas yang rendah sehingga cocok untuk diterapkan pada pemeriksaan terhadap populasi dan bukan pada serifikasi individu hewan. Metode pengujian ini tidak dapat membedakan antara indeksi dan vaksinasi. Oleh OIE, metode uji ini dianjurkan sebagai metode uji alternatif.