Prosedur ini dapat dilaksanakan dengan melaksanakan kultur terhadap jaringan tubuhatau sekret seperti darah, air susu, dan cairan kelamin. Sensitivitas yang lebih tinggi dan waktu kultur yang lebih cepat dapat dicapai pada pasien yang telah mengalami treatment sebelumnya dengan menggunakan antibiotik, ketika dilaksanakan kultur terhadap sunsum tulang belakang. Spesies Brucella dapat juga dikultur dengan menggunakan sampel yang berasal dari pus, cairan cerebrospinal dan
cairan pleura, sendi dan ascites. Pertumbuhan bakteri pada media kultur merupakan bukti yang tegas terhadap proses infeksi yang terjadi. Kultur darah hanya akan berguna pada hewan yang mengalami bakteremia, yang mana tidak selalu terjadi. Namun demikian, dengan melaksanakan metode uji ini, sering diketemukan bakteri ini pada sampel air susu. Sampel berupa nodus lymphatikus, liver, limpa, ambing dan organ yang lain yang diambil pada kondisi post-mortem dapat memberikan hasil positif dengan menggunakan metode uji kultur namun memberikan hasil negatif ketika diuji dengan metode serologis. Dalam hal ini, metode kultur telah digunakan secara luas dalam dunia penelitian.
cairan pleura, sendi dan ascites. Pertumbuhan bakteri pada media kultur merupakan bukti yang tegas terhadap proses infeksi yang terjadi. Kultur darah hanya akan berguna pada hewan yang mengalami bakteremia, yang mana tidak selalu terjadi. Namun demikian, dengan melaksanakan metode uji ini, sering diketemukan bakteri ini pada sampel air susu. Sampel berupa nodus lymphatikus, liver, limpa, ambing dan organ yang lain yang diambil pada kondisi post-mortem dapat memberikan hasil positif dengan menggunakan metode uji kultur namun memberikan hasil negatif ketika diuji dengan metode serologis. Dalam hal ini, metode kultur telah digunakan secara luas dalam dunia penelitian.
Identifikasi spesies Brucella dalam kultur bergantung kepada banyak faktor fenotipe seperti : kebutuhan CO2, karakter phague, dan uji-uji biokimia yang mana, diantara masalah lainnya, termasuk waktu, keamanan, personel terlatih dan kemampuan interpretasi terhadap hasil yang agak ambigu. Untuk kulturorganisme Brucella, media kaldu maupun agar dapat dibuat dari bahan yang berbentuk tepung. Pada kondisi dimana konsentrasi organisme Brucella pada darah atau cairan lainnya hanya sedikit, lebih direkomendasikan untuk menggunakan media kaldu atau media biphasic.
Namun demikian, untuk spesimen lainnya, media solid dengan kandungan agar 2,5% dapat membantu pengenalan koloni dan mencegah disosiasi bakteri. Kondisi pH yang optimum bagi pertumbuhan bakteri Brucella bervariasi antara 6,6 – 7,4,dan medmia kultur harus dikondisikan sehingga memiliki pH pada kisaran 6,8 untuk dapat menghasilkan pertumbuhan yang optimum. Temperatur yang optimum bagi pertumbuhan bakteir adalah 36-38°C. Namun demikian, strain kebanyakan akan tumbuh pada suhu 20-40°C.
Kebanyakan dari strain Brucella, terutama Brucella abortus biovar 2 dan Brucella ovis akan tumbuh lebih baik pada media kultur dengan kandungan serum steril (dari kuda atau sapi) 5-10%, dan bebas dari antibodi Brucella. Untuk menghindari tumbuhnya kontaminan yang merupakan kendalan umum dalan penanganan sampel dari lapangan, maka harus digunakan media selektif. Media selektif yang paling banyak digunakan adalah Kuzdas dan Morse dan media selektif Farrel. Media selektif Kuzdas dan Morse menggunakan jenis antibiotik seperti disebutkan berikut beserta jumlah per liter medium basal : 100 mg cycloheximide (fungistat), 25.000 unit of bacitracin (aktif melawan bakteri gram positif) dan 6.000 unit polymyxin B (aktif melawan bakteri gram negatif). Media selektif Farrel dipersiapkan dengan menambahkan antibiotik seperti disebutkan berikut beserta jumlah per liter medium basal : bacitracin (25 mg), polymyxin B sulphate (5 mg), asam nalidixic (5 mg), nystatin (100,000 unit), vancomycin (20 mg), natamycin (50 mg).
Sebagai media selektif, Farrell bersifat sedikit menginhibisi beberapa strain dari Brucella abortus, Brucella mellitensis dan Brucella ovis, media Thayer Martin yang telah dimodifikasi dapat digunakan bersamaan dengan media selektif Farrell untuk dapat meningkatkan pertumbuhan dari spesies-spesies tersebut. Media ini dipersiapkan dengan menggunakan media GC sebagai media basal ditambah dengan 1% hemoglobin dan sejumlah antibiotik dalam ukuran per-liter sebagai berikut : Colistin methane-sulphonate (7.5 mg), vancomycin (3 mg), nitrofurantoin (10 mg), nystatin (100,000 unit) and amphotericin B